中藥有效成分常見色譜前處理方法

*步：提取法： 　　用相應(yīng)的溶劑使有效成分溶解出來的，溶劑根據(jù)有機(jī)物的性質(zhì)來選擇。可以冷浸，如果穩(wěn)定性允許，為加速溶解的過程，可采用超聲處理，加熱回流（包括索氏提取）。選擇適當(dāng)?shù)娜軇┛梢詼p少雜質(zhì)。基本原則是能用純的甲、乙醇不用帶水的，能用非極性的不用極性的，因?yàn)橄龢O性雜質(zhì)一般比非極性的麻煩。根據(jù)相似相溶的原則，非極性溶劑溶解的極性物質(zhì)較少。　　蒸餾（多為水蒸氣蒸餾）也較多使用，同時(shí)具有提取和一定的分離作用。　　某些物質(zhì)還可以用升華法：樟腦，咖啡堿（178℃以上就能升華而不被分解）等。升華法易產(chǎn)生揮發(fā)性的焦油狀物，粘附在升華物上，不易除去，另外，升華不*，甚至?xí)纸猓荒苡糜诤繙y(cè)定。　　

第二步：分離和純化：

1、液液萃取　　基本上都是水溶后，用乙酸乙酯、乙醚、氯仿、石油醚等與水不相溶的有機(jī)溶劑。一般分析的量較少，微溶于水的物質(zhì)都可以用液液萃取的方法。通過合適的酸化/堿化步驟，可有效的去除雜質(zhì)。

2、沉淀　　利用重金屬等與待分析物形成絡(luò)和物或難溶鹽沉淀而分離，然后再用酸、堿等把它還原出來。鉛鹽常用以沉淀有機(jī)酸、氨基酸、蛋白質(zhì)、粘液質(zhì)、鞣質(zhì)、樹脂、酸性皂甙、部分黃酮等。例如含綠原酸的溶液加醋酸鉛溶液，攪拌使沉淀，離心，棄去上清液，沉淀物加5％硫酸溶液，用醋酸乙酯萃取。常用雷氏銨鹽使生成生物堿沉淀析出。橙皮甙、蘆丁、黃芩甙均易溶于堿性溶液，加入酸后可使之沉淀析出。某些蛋白質(zhì)，可以變溶液的pH值利用其在等電點(diǎn)時(shí)溶解度zui小的性質(zhì)而使之沉淀析出。此外，還可以用明膠、蛋白溶液沉淀鞣質(zhì)；膽甾醇也常用以沉淀洋地黃皂甙等。

3、析出法：包括鹽析和改變?nèi)軇O性析出。　　鹽析法是在水溶液中、加入無機(jī)鹽，可使某些成分在水中的溶解度降低沉淀析出，而與水溶性大的雜質(zhì)分離。常用作鹽析的無機(jī)鹽有氯化鈉、*、硫酸鎂、硫酸銨等。三七皂甙乙、掌葉防己堿，小檗堿等都可以用種方法。不過，一般分析上是在水溶液中加入一定量的食鹽，再用有機(jī)溶劑萃取，例如麻黃堿、苦參堿等水溶性較大的物質(zhì)。　　改變?nèi)軇O性析出是在溶液中加入不同極性的溶劑是物質(zhì)析出。就像生產(chǎn)中水提醇沉、醇提水沉。   

4、柱色譜法：　　常用的固定相有硅膠、氧化鋁、聚酰胺、大孔樹脂、活性炭、硅藻土等。柱色譜法有兩種，是簡(jiǎn)單的吸附解吸，理論塔板數(shù)相當(dāng)于一，跟萃取差不多，也可稱富集，例如像現(xiàn)在用得很廣的SPE（solid phase extract）。另外一種則是像色譜Tswett那樣，樣品加在柱上形成一窄帶，然后再分步或連續(xù)洗脫。　　*種較簡(jiǎn)單，活化后，按要求預(yù)處理，然后讓樣品溶液通過吸附劑，吸附飽和后，根據(jù)不同物質(zhì)的解吸條件，選擇不同吸脫溶劑吸脫下來。關(guān)于SPE小柱的使用這里不介紹了，僅舉一更實(shí)際的例子：取天麻細(xì)粉5g，加甲醇50ml，水浴加熱回流1小時(shí)，過濾，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0ml溶解，用氯仿萃取2次，每次10ml，棄去氯仿液。水液加熱揮去殘余氯仿，加活性炭（不活化）2g，微沸20分鐘，放冷，加硅藻土1g，攪拌均勻，用濾紙過濾，再以40ml水洗滌殘?jiān)瑸V液棄去；殘?jiān)谒∩细稍锇胄r(shí)，然后置錐形瓶中，加無水乙醇50ml，回流半小時(shí)，過濾，濾液濃縮至干，加甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液。其實(shí)，如果不是含量測(cè)定的話，上面的做法可以達(dá)到目的。如果是含量測(cè)定，那就要用柱子，并確定一下吸附劑的使用量，防止待測(cè)物損失。　　第二種方法，zui重要的是讓樣品在柱上形成窄帶。我們可以近似的認(rèn)為，窄帶的高度相當(dāng)于理論塔板高度，柱長(zhǎng)除以理論塔板高度就是理論塔板數(shù)了。實(shí)際上洗脫時(shí)，待測(cè)成分在柱上的實(shí)際高度不一定等于窄帶的高度。如果用洗脫劑直接溶解樣品，就可以直接上柱了。如果不是的話，就要用一定的吸附劑吸附樣品，在把樣品的溶劑揮干后，在加到柱子。洗脫條件應(yīng)通過實(shí)驗(yàn)確定，包括洗脫溶劑、洗脫體積、洗脫速度。　　根據(jù)不同的吸附劑，具體的應(yīng)用不同： （1）硅膠：硅膠顆粒表面有很多硅醇基。硅膠吸附作用的強(qiáng)弱與硅醇基的含量多少有關(guān)。硅醇基能夠通過氫鍵作用吸附水分而降低吸附能力，硅膠的吸附性根據(jù)其含水量不同分成多個(gè)級(jí)別。硅膠的活化：100～110℃時(shí)，硅膠表面水分即能被除去；500℃時(shí)，硅膠表面的硅醇基脫水縮合轉(zhuǎn)變?yōu)楣柩跬殒I，失去吸附性。硅膠是酸性吸附劑，用于中性或酸性成分分離。不活化的硅膠，可利用分配原理分離色素。硅膠又是一種弱酸性陽離子交換劑，其表面上的硅醇基能釋放弱酸性的氫離子，所以可作為離子交換劑，分離堿性化合物。吸附硅膠柱的洗脫溶劑成很多，從非極性到極性的順序洗脫。 （2）氧化鋁：氧化鋁偏堿堿性，zui適宜用于生物堿類的分離，不宜用于醛、酮、醋、內(nèi)酯等類型的化合物分離。氧化鋁用水洗至中性，稱為中性氧化鋁，中性氧化鋁適用于酸性成分的分離。氧化鋁用稀硝酸或稀鹽酸處理，可使氧化鋁顆粒表面帶有硝酸根或氯離子，制成酸性氧化鋁，酸性氧化鋁具有離于交換劑的性質(zhì)。中性氧化鋁使用zui多，柱層析用的中性氧化鋁粒度應(yīng)在100～200目之間。粒度大，分離效果差：小則洗脫速度慢，縱向擴(kuò)散。中性氧化鋁的活化與硅膠差不多。中性氧化鋁柱的洗脫溶劑溶劑組成很多，從非極性到極性的順序洗脫。 （3）聚酰胺：尼龍與酰胺類化合物形成的高分子聚合物，分子上有很多酰胺基，可與酚類、酸類、醌類、硝基化合物形成氫鍵。適用于酚性化合物如黃酮的分離。一般聚酰胺不需活化或預(yù)處理就可以裝柱。提取液或提取物上柱后，用水洗雜質(zhì)，用不同比例的醇的水溶液從低濃度到高濃度依次洗脫。 （4）大孔樹脂：具有立體結(jié)構(gòu)的多孔性聚合物，有巨大的比表面積，通過范德華力吸附有機(jī)物。以前的大孔樹脂多用汽油等作致孔劑，需要用丙酮加熱回流來預(yù)處理，現(xiàn)在可購(gòu)買純度較高的，使用前只需用甲醇、或乙醇洗滌至洗出液滴在水中不產(chǎn)生白色即可。再生樹脂的方法是，用2%～5%的鹽酸浸泡洗滌，用水洗到中性，然后用5%*浸泡洗滌，用水洗到中性即可。樹脂含水量70%左右，如不慎樹脂干了，可用乙醇或丙酮浸漬處理，然后再用。按實(shí)際情況，酸、堿濃度可增減。大孔樹脂類型很多，zui多用的是D101。多用于皂苷、黃酮、內(nèi)酯、萜類和色素的分離。提取液或提取物上柱后，用水洗雜質(zhì)，用不同比例的醇的水溶液從低濃度到高濃度依次洗脫。 （5）活性炭：一般需要先用稀鹽酸洗滌，其次用乙醇洗，再以水洗凈，于80℃干燥后再用。上柱用的活性炭，選用顆粒活注炭，若為活性炭細(xì)粉，則需加入適量硅藻土作為助濾劑一并裝柱，以免流速太慢。活性炭主要且于分離水溶性成分。活性炭對(duì)芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物，對(duì)大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。可將水溶性芳香族物質(zhì)與脂肪族物質(zhì)分開，單糖與多糖分開，氨基酸與多肽分開。提取液或提取物上柱后，用水洗雜質(zhì)，用不同比例的醇的水溶液從低濃度到高濃度依次洗脫。 （6）硅藻土：采用不同pH緩沖液的硅藻土分配色譜柱，可分離生物堿、酸性生物堿和中性物質(zhì)。提取液或提取物上柱后，用乙醚或氯仿洗下色素、脂肪、中性雜志，然后用胺性醇洗下生物堿。 　　 十八烷基硅烷基硅烷堿合硅膠、其它類型鍵合硅膠、DEAE纖維素、其他纖維素、離子交換樹脂應(yīng)用的較少，這里略去。